Strukturelle Grundlagen der Ionenaufnahme in Kupfer

Mar 01, 2024

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 5121 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Kupfer ist für lebende Zellen lebenswichtig, in erhöhten Konzentrationen jedoch giftig. ATPasen vom P-Typ (P1B-) der Klasse 1B sind in allen Lebensbereichen vorhanden und erleichtern den zellulären Export von Übergangsmetallen, einschließlich Kupfer. ATPasen vom P-Typ folgen einem alternierenden Zugriffsmechanismus mit nach innen gerichteten E1- und nach außen gerichteten E2-Konformationen. Dennoch sind für P1B-ATPasen keine Strukturinformationen zu E1-Zuständen verfügbar, was das mechanistische Verständnis erschwert. Hier präsentieren wir Strukturen, die eine Auflösung von 2,7 Å einer kupferspezifischen P1B-ATPase in einer E1-Konformation erreichen, mit ergänzenden Daten und Analysen. Unsere Bemühungen offenbaren eine Domänenanordnung, die Raum für die Interaktion mit ionenspendenden Chaperonen schafft, und legen einen direkten Cu+-Transfer zum Transmembrankern nahe. Ein Methionin spielt eine Schlüsselrolle, indem es die Freisetzung des Chaperon-gebundenen Ions unterstützt und zusammen mit den Cysteinen des CPC-Signaturmotivs eine Frachteintrittsstelle bildet. Insgesamt liefern die Ergebnisse Einblicke in den P1B-vermittelten Transport, der wahrscheinlich auch auf menschliche P1B-Mitglieder anwendbar ist.

Kupfer ist ein Übergangsmetall, das lebenswichtige Funktionen in Zellen ausübt und daher ein essentieller Mikronährstoff für Organismen in allen Lebensbereichen ist. Seine Fähigkeit zum Redoxzyklus zwischen reduziertem (Cu+) und oxidiertem (Cu2+) Zustand wird in einer Reihe von Schlüsselenzymen genutzt, z. B. der Cytochrom-C-Oxidase oder der NADH-Dehydrogenase, die für grundlegende Stoffwechselprozesse wie die Zellatmung von entscheidender Bedeutung sind1. Dennoch kann freies intrazelluläres Kupfer die Bildung toxischer Hydroxylradikale auslösen und andere Metalle aus Proteinen verdrängen2. Folglich werden die intrazellulären Kupferspiegel streng reguliert, vermittelt durch zahlreiche spezielle Chaperone, Regulatoren und Exportproteine, insbesondere kupfertransportierende P-Typ-ATPasen.

ATPasen vom P-Typ bilden eine große Superfamilie, die die Energie aus der ATP-Hydrolyse an den Transport von Ladung durch biologische Membranen koppelt. Sie sind in fünf Unterfamilien, P1-5, mit bis zu vier Unterklassen, AD, unterteilt, basierend auf Sequenzidentität und Transportspezifität3, die von Metallkationen bis hin zu Phospholipiden4, Polyaminen5 und Transmembranhelices6 reicht. Die übergangsmetallspezifische Unterklasse 1B (P1B-ATPasen) katalysiert den Ausfluss von z. B. Zn2+, Co2+, Fe2+ aus dem Zellinneren und umfasst kupferspezifische Mitglieder, die historisch in P1B-1- (CopA) und P1B-3- unterteilt wurden. ATPasen (CopB)7,8. P1B-ATPasen sind in Prokaryoten reichlich vorhanden und schützen den Organismus vor Schwermetallstress. Beim Menschen sind zwei CopA-Proteine ​​vorhanden: ATP7A und ATP7B. Eine Fehlfunktion dieser Mitglieder führt zu den schweren neurologischen Erkrankungen Menkes- bzw. Wilson-Krankheit9,10.

P-Typ-ATPasen haben eine gemeinsame Gesamtarchitektur, die aus drei zytosolischen (Aktuator- (A-), Phosphorylierungs- (P-) und Nukleotidbindungs- (N-)) Domänen sowie einer membrandurchspannenden (M-) Domäne bestehend aus sechs allgegenwärtigen Domänen besteht Transmembranhelices, M1-M6 (Ergänzende Abbildung 1). Darüber hinaus besitzen P1B-ATPasen zwei N-terminale Transmembranhelices MA und MB sowie ein bis sechs typischerweise N-terminale Schwermetallbindungsdomänen (HMBDs), wobei letztere eine rätselhafte Rolle für die Funktion im Zusammenhang mit der Ionenaufnahme und/oder spielen Verordnung11,12,13. Die Superfamilie folgt dem sogenannten Post-Albers-Reaktionszyklus, einem alternierenden Zugangsmechanismus, der durch nach innen gerichtete E1- und nach außen gerichtete E2-Konformationen mit hoher bzw. niedriger Affinität für die transportierte Ladung vom Zytoplasma (innen) nach extrazellulär/luminal definiert wird (Außen-)Seiten (Abb. 1)14,15. Die Aufnahme und Okklusion von Ladung aus dem Zytosol erfolgt in E1-Konformationen, und zusammen mit der ATP-abhängigen Phosphorylierung eines invarianten, katalytischen Aspartats in der P-Domäne, die die E1P-Form ergibt, führt dies zum Übergang in den nach außen gerichteten E2P-Zustand. Die Ladung wird dann in den extrazellulären Raum abgegeben und nach der Dephosphorylierung (E2) kehrt die Pumpe in die nach innen gerichtete E1-Konformation zurück.

a Die Struktur zeigt den typischen P-Typ-ATPase-Domänenaufbau mit drei zytosolischen A- (gelb gefärbt), P- (blau) und N- (rot) Domänen und einer membrandurchspannenden M-Domäne. Die P1B-spezifischen MA-MB-Helices sind in Cyan und M1-6 in Grau dargestellt. Funktionell wichtige Merkmale und Motive werden hervorgehoben. b Post-Albers-Reaktionszyklus. Einschübe zeigen die P-Domänen-Strukturausrichtungen der ermittelten AfCopA- (E1-Zustand) und der verfügbaren LpCopA-Strukturen (E2P und E2.Pi; PDB-IDs 4BBJ und 4BYG) (in Farben) zu den entsprechenden Zuständen von SERCA (in Grau; 4H1W). , 3B9B & 3FGO), wobei die M-Domänen aus Gründen der Übersichtlichkeit entfernt wurden. Die E2-Staaten weisen erhebliche Überschneidungen mit SERCA auf, während die festgelegte E1-Struktur eine ausgeprägte Organisation aufweist.

Bisher sind Strukturinformationen zum P1B-ATPase-Kern auf Strukturen von CopA aus Legionella pneumophila (LpCopA), ATP7B aus Xenopus Tropicalis und ZntA aus Shigella sonnei in E2P- und E2.Pi-Konformationen beschränkt16,17,18,19 als einzelne lösliche Domänen und ein niedrigaufgelöstes Kryo-EM-Modell von CopA aus Archaeoglobus fulgidus (AfCopA)20,21,22. Folglich wurde keine metallgebundene (E1) Konformation einer P1B-ATPase beschrieben, sodass grundlegende mechanistische Prinzipien bezüglich Ionenaufnahme, -übertragung und -bindung unklar bleiben. Typischerweise liefern Cuproproteine ​​in vivo Kupfer an P1B-ATPasen, d. h. Archaeoglobus fulgidus CopZ an AfCopA23 oder homologes Atox1 an menschliches ATP7A/B. Obwohl vorgeschlagen wurde, dass eine elektropositive Plattform, MB', zwischen MB und M1 an der Rekrutierung von CopZ24 beteiligt ist, sind die molekularen Determinanten des Chaperon-vermittelten Cu+-Transfers auf die ATPase unklar. Hier berichten wir über drei nach innen gerichtete E1-Strukturen einer kupfertransportierenden P-Typ-ATPase, die grundlegende Einblicke in die Ionenaufnahme und den Ionentransport durch die gesamte P1B-Unterklasse liefern.

Um den Ioneneintritts- und Transportmechanismus von P1B-ATPasen weiter zu beleuchten, haben wir CopA aus dem Modellorganismus Archaeoglobus fulgidus mithilfe eines verkürzten Konstrukts gezielt, dem sowohl die N- als auch die C-terminale Schwermetallbindungsdomäne fehlt (AfCopAΔNΔC). Die Kristallisation wurde in Gegenwart hoher Lipid- und Detergenskonzentrationen (HiLiDe-Methode25) und 0,5 mM CuSO4 durchgeführt, was Kristalle mit einer Beugungsauflösung von 2,7 Å ergab. Die Struktur wurde mithilfe des molekularen Ersatzes als Phasenmethode bestimmt. Das endgültige Modell ergab ein R/Rfree von 22,5/25,7 (Ergänzungstabelle 1) und ermöglichte die Modellierung von Seitenketten in der A-, P- und den meisten Teilen der M-Domäne, wohingegen in der N-Domäne eine etwas geringere lokale Auflösung beobachtet wurde , wahrscheinlich aufgrund des Fehlens von Nukleotiden und des Fehlens von Kristallkontakten in dieser Region (Ergänzende Abbildungen 2–3 und Methoden).

Die wiederhergestellte AfCopA-Struktur weist die erwartete P1B-ATPase-Architektur16,17,18,19,26 auf, einschließlich der zytosolischen A-, P- und N-Domänen und insgesamt acht membrandurchspannenden Helices, MA, MB und M1-M6. Diese molekularen Pumpen unterscheiden sich klar von anderen Arten von P-Typ-ATPasen (Abb. 1a und ergänzende Abb. 1). Allerdings liegt die Nukleotidbindungstasche der N-Domäne dem katalytischen Aspartat (D424) in der P-Domäne gegenüber, während zwischen der A- und der N-Domäne ein großer Abstand besteht, der deutlich von zuvor bestimmten Konformationen von P1B abweicht. ATPasen. Um die bestimmte AfCopA-Struktur in den gesamten P-Typ-ATPase-Reaktionszyklus zu integrieren, führten wir strukturbasierte Alignments der löslichen Domänen mit den verfügbaren Strukturen der gut untersuchten Ca2+-transportierenden Sarco/endoplasmatischen Retikulum-P-Typ-ATPase (SERCA) durch. zeigt höchste Ähnlichkeiten zu [Ca]2 E1·ATP-Konformationen (PDB-IDs 3N8G, 1T5S und 1T5T) (ergänzende Abbildung 4)27. Dies war unerwartet, da die AfCopA-Kristalle in Gegenwart von Ladung erzeugt wurden, jedoch ohne ATP oder nicht hydrolysierbare Analoga davon, d. h. äquivalent zu Bedingungen, die frühe E1-Zustände von SERCA einfangen. Darüber hinaus ergaben Kristalle von AfCopA, die in Abwesenheit von Kupfer und Nukleotiden erhalten wurden, eine Struktur in einer ähnlichen Gesamtkonformation, was wiederum auf eine frühe E1-Konformation und möglicherweise auf eine E1-Präferenz (Grundzustand) für dieses bestimmte CopA-Mitglied hinweist (Ergänzende Abbildungen 3– 5 & ​​Methoden).

Die Positionen der konservierten Dephosphorylierungs- ((T/S)GE) und Nukleotidbindungsmotive (HP) der A- bzw. N-Domänen relativ zur P-Domäne in der ermittelten AfCopA-Struktur weisen jedoch keine Ähnlichkeiten mit auf eine der verfügbaren Strukturen von SERCA (Abb. 1 und ergänzende Abbildungen 4 und 6). Dies steht im Gegensatz zu den zuvor berichteten E2P- und E2.Pi-Strukturen von P1B-ATPAsen, die sich gut mit den entsprechenden SERCA-Konformationen überlagern (Abb. 1b und ergänzende Abb. 4). Die besondere Anordnung der AfCopA-löslichen Domänen im bestimmten E1-Zustand relativ zu SERCA wird besonders deutlich, wenn man die Position der invarianten (T/S)GE-Dephosphorylierungsschleife der A-Domäne betrachtet. In der AfCopA-Struktur befindet es sich am Ende von M4, während es sich in E1-Strukturen von SERCA (PDB-IDs 4H1W und 3N8G) auf der anderen Seite der P-Domäne befindet (Abb. 1b und ergänzende Abb . 7).

Bemerkenswert ist, dass die Konfiguration der AfCopA-löslichen Domänen eher den kürzlich bestimmten E1- und E1P-Zuständen der P-Typ-ATPase KdpB der Klasse 1A ähnelt, die Teil des KdpFABC-Komplexes 30, 31 ist (ergänzende Abbildung 7). Die beobachteten Ähnlichkeiten zwischen P1A- und P1B-ATPasen können durch den gemeinsamen evolutionären Ursprung und die ähnliche Topologie der Unterfamilien erklärt werden, d. h. das Fehlen einer N-terminalen A-Domänenverlängerung und der Helices M8–10, die in anderen Klassen vorhanden sind von P-Typ-ATPasen. Die Integration von KdpB in den KdpFABC-Komplex macht es jedoch zu einem atypischen Mitglied der P-Typ-ATPase-Superfamilie, und P1B-ATPasen funktionieren wahrscheinlich auf völlig andere Weise. Wir kommen daher zu dem Schluss, dass die bestimmte AfCopA-Struktur einer abweichenden E1-Konformation ähnelt, was wahrscheinlich die Wirkungsweise der P1B-ATPase beeinflusst.

Strukturvergleiche mit der zuvor bestimmten E2.Pi-Struktur von LpCopA16 offenbaren größere Umlagerungen während des E2 → E1-Übergangs (Abb. 2 und ergänzende Abb. 8). Am auffälligsten ist, dass eine große A-Domänenrotation von etwa 100° relativ zur P-Domäne das konservierte (T/S)GE-Dephosphorylierungsmotiv vom katalytischen Aspartat der P-Domäne verschiebt und es unmittelbar in die Nähe des Endes von positioniert M4, wo es durch elektrostatische Wechselwirkungen mit der P-Domäne stabilisiert wird (ergänzende Abbildung 9). Die CopA-A-Domäne und das (T/S)GE-Motiv unterliegen vom Zytosol aus gesehen einer Drehung gegen den Uhrzeigersinn relativ zur P-Domäne. Zusammen mit der Verschiebung der A-Domäne wird die N-Domäne gekippt, wodurch das zytosolische Kopfstück geschlossen wird und die Nukleotidbindungstasche für die ATP-Bindung vorbereitet wird (ergänzende Abbildung 10).

M-Domänen-Lösungsmittelzugängliche Regionen (Weizen) von a, b der hier bestimmten AfCopA-E1-Struktur und c, d dem E2P-Zustand von LpCopA (PDB-ID 4BBJ mit den als AfCopA nummerierten Resten). In der AfCopA E1-Struktur ist das konservierte CPC-Motiv in M4 dem Zytosol ausgesetzt, wohingegen die LpCopA E2-Konformation nach außen offen ist. e Die Ausrichtung des AfCopA-E1-Zustands an der P-Domäne von LpCopA (PDB-ID 3RFU) veranschaulicht Konformationsänderungen während des Übergangs E2.Pi → E1, am auffälligsten eine große Rotation der A-Domäne. f Distanzdifferenzmatrix der M-Domäne zur Erkennung relativer Bewegungen zwischen Helices63. Zu diesem Zweck wurde mit SwissModel52 ein Homologiemodell von AfCopA basierend auf der E2.Pi-Struktur von LpCopA generiert und MA-M6 manuell zugewiesen. MA-M2 und M3-M6 ordnen sich relativ zueinander kaum neu an und bilden daher zwei separate Helicesbündel, während zwischen den Unterdomänen Änderungen von bis zu 6 Å auftreten.

Die Drehung der A-Domäne um E2 → E1 gegen den Uhrzeigersinn ähnelt der Situation in KdpB31, ist jedoch entgegengesetzt zu SERCA, wo sich das TGE-Motiv im Uhrzeigersinn dreht (ergänzende Abbildung 7). Aber was ist die mechanistische Konsequenz und der Ursprung dieses grundlegenden Unterschieds zwischen P1- und P2-ATPasen? Der eindeutige Standort der A-Domäne in CopA und SERCA muss durch die Gesamtarchitektur vorgegeben werden. Wie oben angegeben, fehlt P1B-ATPasen die N-terminale A-Domänenverlängerung und folglich der A/M1-Linker. In SERCA bestimmt diese Verbindungsstrecke den Zwischenraum zwischen M1 und dem distalen Teil der A-Domäne, wobei der Abstand zwischen den Zuständen E2.Pi und E1 im Wesentlichen konstant bleibt (ergänzende Abbildung 11). Dies ist von besonderer Bedeutung, da die Länge des A/M1-Linkers bekanntermaßen entscheidend für den SERCA-Reaktionszyklus ist, wobei Insertionen oder Deletionen die ATPase-Aktivität aufheben32. Umgekehrt ist die A-Domäne aufgrund des Fehlens der N-terminalen A-Domänenverlängerung in P1B-ATPasen weniger konformativ eingeschränkt und der oben genannte Abstand verringert sich während des Übergangs E2.Pi → E1 von 69 auf 65 Å (Ergänzende Abb . 11).

Analog beeinflussen Modifikationen des A/M3-Linkers, der in E1-Zuständen im Allgemeinen eine längliche, lockere Form annimmt, während er in E2-Konformationen strukturierter ist, die Funktion von SERCA33,34. Diese Verschiebung des Transportzyklus in SERCA wird wahrscheinlich durch stabilisierende elektrostatische Wechselwirkungen zwischen den A- und P-Domänen in den E2-Konformationen unterstützt. Die Teile der P- und A-Domänen, die diese Wechselwirkungen bilden, fehlen jedoch in P1B-ATPasen (ergänzende Abbildung 9). Das Fehlen dieser Merkmale verleiht der P-Domäne von CopA einen insgesamt elektronegativen Oberflächenfleck, der eine Wechselwirkung mit elektropositiven Resten der A-Domäne auch in der bestimmten E1-Konformation ermöglicht (ergänzende Abbildung 9). Infolgedessen wird der A/M3-Linker beim Übergang E2.Pi → E1 um 4,6 Å verkürzt, während der Abstand in SERCA um 3,3 Å vergrößert wird (ergänzende Abbildung 11).

Insgesamt zeigt dies, dass die im Verlauf des Transportmechanismus auf die A-Domäne ausgeübten Push-and-Pull-Kräfte zwischen P1- und klassischen P2-ATPasen deutlich unterschiedlich sind, was mit der festgestellten atypischen Anordnung der A-Domäne übereinstimmt. Domäne von CopA. Man kann spekulieren, dass das postulierte Fehlen von Gegenionen und strukturellen Unterschieden wie dem fehlenden A/M1-Linker in P1B-ATPasen11 zu der Notwendigkeit einer alternativen Stimulation des E2.Pi → E1-Übergangs führt. Die strengeren Beschränkungen der A/M1- und A/M3-Linker im E1-Zustand können diesem Zweck dienen und die Rotation der A-Domäne antreiben, die zum Erreichen der E1-Konformation erforderlich ist.

Unerwarteterweise bilden MA-M2 und M3-M6 in der M-Domäne jeweils ein Helixbündel, die sich beim Übergang E2.Pi → E1 relativ zueinander bewegen, wie unvoreingenommene Analysen der relativen Positionen jeder Transmembranhelix in zeigen die beiden Staaten (Abb. 2 & ergänzende Abb. 12). In der ermittelten E1-Struktur konvergieren M2 und M6 im Schnittpunkt dieser Teilgebiete. Infolgedessen wird der zuvor vorgeschlagene Ionenaustrittsweg blockiert, sodass er von außen nicht mehr zugänglich ist, wie aus der Analyse mit der Software HOLLOW17,35 hervorgeht (Abb. 2a–d). Im Gegensatz dazu ist auf der gegenüberliegenden Seite das Innere des Proteins der intrazellulären Umgebung ausgesetzt. Somit weist die ermittelte Struktur eine nach innen gerichtete E1-Konformation auf.

Ungeachtet des Fehlens von Strukturinformationen wurde die Kupferbindung an P1B-ATPasen ausführlich untersucht36,37,38. Basierend auf der Pearson-Säure-Base-Theorie (HSAB) wird erwartet, dass Cu+ mit einer relativ geringen Ladung und „weicher“ Natur im Gegensatz dazu günstiger von „weicheren“ und polarisierbareren Cysteinen, Methioninen und in geringerem Maße von Histidinen koordiniert wird zu anderen Metallionen39. Dementsprechend wurde vorgeschlagen, dass die Ionenaufnahme aus dem Zytosol über eine Eintrittsstelle erfolgt, die durch das konservierte M158 (am MB'-M1-Übergang), E205 (M2) und D336 (M3) gebildet wird16,17,24. Später wurde ein alternatives schwefelbasiertes Modell eingeführt, bei dem Cu+ an eine vorübergehende Stelle bindet, die von M158 zusammen mit C380 und C382 des CPC-Motivs gebildet wird und sich an einer charakteristischen Knickstelle von M438 befindet. Das Ion würde dann von der Eintrittsstelle oder/über die Übergangsstelle zu den hochaffinen Liganden in der M-Domäne transportiert. Es wird eine hochaffine Ionenbindung zwischen den Transmembranhelices M4–M6 erwartet, die mehrere invariante Aminosäuren enthalten, darunter die CPC-Reste sowie Y682, N683, M711, S714 und S715 der YN- (M5) und MxxSS- (M6) Motive8.

In der ermittelten AfCopA-Struktur sind C380 und C382 im Gegensatz zu den E2P- und E2.Pi-Konformationen von LpCopA16,17 oberflächenexponiert und auf M1-2 ausgerichtet, einschließlich M158 im endgültigen Modell, was wiederum auf eine frühe E1-Konformation hinweist, die mit der Ionenaufnahme übereinstimmt ( Abb. 2a & 3a). Obwohl die Anordnung von M158, C380 und C382 mit der Cu+-Koordination in Verbindung mit der oben erwähnten Übergangsstelle übereinstimmt, konnten wir das Vorhandensein von Metallen im hochauflösenden Datensatz nicht eindeutig zuordnen (Abb. 4d). Umgekehrt sind Y682, N683 und M711 dem Zentrum von M4-6 zugewandt und für die anschließende hochaffine Cu+-Bindung vorbereitet, was zu einer erheblichen Verschiebung von M711 relativ zur E2.Pi-Konformation führt, wo es der umgebenden Membran ausgesetzt ist (Abb . 3d). Um die funktionelle Bedeutung dieser konservierten Reste für den AfCopA-vermittelten Kupfertransport zu untersuchen, führten wir In-vitro-ATPase-Aktivitätsmessungen an in Liposomen rekonstituierten Proteinen durch (Methoden). Der ermittelte Cu+-stimulierte Umsatz von Wildtyp-AfCopAΔNΔC betrug 242 ± 26 nmol Pi mg−1 min−1. Alanin-Substitutionen der M4-6-Reste hoben die Funktion auf, während weniger dramatische Auswirkungen für die Aminosäuren festgestellt wurden, von denen zuvor angenommen wurde, dass sie an der Ionenaufnahme beteiligt sind (Abb. 3a), was mit früheren Beobachtungen an CopA-Proteinen übereinstimmt17,38,40. Darüber hinaus haben wir die Cu+-Bindung an AfCopAΔNΔC und ausgewählte Alaninsubstitutionen mittels Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) gemessen und dabei eine durchschnittliche Stöchiometrie von 0,87 ± 0,10 Cu+-Ionen pro AfCopAΔNΔC-Protein ermittelt (Abb. 3b). Die Cu+-Bindung wurde insbesondere durch Mutation der Cysteinreste C380 und C382 im konservierten CPC-Motiv in M4, aber auch der YN- (M5) und MxxSS-Motive (M6) beeinträchtigt (Abb. 3b). Daher stützen unsere Daten die Notwendigkeit zahlreicher konservierter Reste in M4-6 für den CopA-vermittelten Cu+-Transport, während die Ausrichtung dieser Seitenketten in der ermittelten Struktur auf eine frühe E1-Konformation schließen lässt, die durch die Neuorientierung zweier Helicesbündel innerhalb der Struktur erreicht wird M-Domäne.

eine Cu+-stimulierte ATPase-Aktivität ausgewählter mutierter Formen, bestimmt durch einen kolorimetrischen In-vitro-ATPase-Assay basierend auf in Liposomen rekonstituiertem Protein. WT-Wildtyp AfCopAΔNΔC. Die Daten wurden für Material aus zwei unabhängigen Reinigungen mit n = 5 (M158A, E205A, D336A, C382A, S714A, S715A, D426N) oder n = 6 (andere Mutanten) gesammelt und als Mittelwert ± SD dargestellt. b Stöchiometrien der Cu+-Bindung, bestimmt durch ICP-MS-Messungen ausgewählter Mutantenformen. Die Daten wurden für Material aus zwei unabhängigen Reinigungen mit n = 5 (E205A) oder n = 6 (andere Mutanten) gesammelt und als Mittelwert ± SD dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. c, d Nahansichten der AfCopA-E1-Struktur, beobachtet von der zytoplasmatischen Seite der relevanten Reste in der Eintrittsregion c und der mutmaßlichen hochaffinen Ionenbindungsregion d, wobei die endgültige Elektronendichte bei σ = 1 im blauen Netz dargestellt ist.

eine elektrostatische Oberflächendarstellung der ermittelten CopA-Struktur. Das CopZ-Docking wurde mit pyDockWEB45 unter Verwendung eines Homologiemodells des C-terminalen Teils von AfCopZ durchgeführt (Einzelheiten siehe Methoden). b Die Verfeinerung des Ensembles um die Cu+-Eintrittsstelle ergab mehrere mögliche Ausrichtungen der M158-Seitenkette. Die elektrostatische Oberfläche wird für drei ausgewählte Ensembles (I-III) gezeigt und zeigt, dass geringfügige Neuorientierungen große Auswirkungen haben. c Modell für die Cu+-Aufnahme basierend auf CopZ-Docking und Ensemble-Verfeinerung. Eine vorübergehende Cu+-Aufnahmestelle wird wahrscheinlich durch die Cu+-koordinierenden Reste (das sogenannte CxxC-Motiv) von CopZ und M158 gebildet, die eine nach oben gerichtete Seitenkettenkonformation ähnlich wie Ensemble II annehmen. Ein Cu+-Transfer von CopZ direkt auf M158 ist möglich, wahrscheinlich ohne Beteiligung von E205 und D336, von denen zuvor angenommen wurde, dass sie an der Ionenaufnahme beteiligt sind16,24. Die Neuausrichtung von M158 führt zur Bildung der in unseren Daten nachgewiesenen vorübergehenden Cu+-Eintrittsstelle zusammen mit C380 und C382 des CPC-Motivs in M4. d An der Cu-Kante gesammelte anomale Daten, die mit dem Vorhandensein eines an C382 gebundenen Cu+-Ions an der Eintrittsstelle vereinbar sind. Die endgültigen 2Fo-Fc- und anomalen Differenzkarten werden im blauen bzw. braunen Netz dargestellt.

Die Anzahl und Lage der hochaffinen Cu+-Bindungsstellen in P1B-1-ATPasen wird diskutiert und stellt ein zentrales ungelöstes Problem auf diesem Gebiet dar. Trotz der offenen Konfiguration unserer Struktur und mit der Absicht, die Details der physikalisch-chemischen Umgebung der Übergangsstelle weiter zu untersuchen, haben wir röntgenkristallographische Daten an der Kupferabsorptionskante (1,37 Å) gesammelt, die auf 3,3 Å beugt. Die MR-SAD-Phasenbestimmung in phenix.autosol41 unter Verwendung der endgültigen AfCopA-E1-Struktur als Suchmodell führte zu einer Unterstruktur mit Hinweisen auf eine einzelne Cu+-Stelle nahe C382 des CPC-Motivs, ohne Anzeichen von Kupfer zwischen M4-6, obwohl dies nicht der Fall sein kann ausgeschlossen, dass sich das Signal auf ein Nicht-Kupfer-Atom bezieht (Abb. 3 und Ergänzungstabelle 1). Eine weitere Verfeinerung ergab eine 60-prozentige Besetzung des Cu+-Ions an der detektierten Position, wobei die Gesamtstruktur erhalten blieb und die Anordnung der Region um die Cu+-Stelle im Vergleich zu dem bei einer Wellenlänge von 1 Å gesammelten Datensatz ähnlich war. Konkret sind beide Cysteine ​​des CPC-Motivs M158 mit einem Abstand von 4,4 und 5,1 Å zugewandt, was mit einer trigonal-planaren Cu+-Koordination übereinstimmt. Tatsächlich unterstützen Molekulardynamiksimulationen (MD) der ermittelten Struktur, die in eine In-Silico-Membran eingefügt wurde, die Koordination von Cu+ von M158, C380 und C382 nach Aufnahme aus der umgebenden wässrigen Umgebung (ergänzende Abbildung 13a, b). Allerdings verändern Alaninsubstitutionen von M158 und den benachbarten N157 und D159 im genutzten Liposomentest die Cu+-stimulierte ATPase-Aktivität in vitro nicht signifikant, im Gegensatz zu einem früheren Bericht mit alternativen experimentellen Einstellungen (siehe weiter unten) (Abb. 2a und 3a). 42. Darüber hinaus verändert die Alaninsubstitution von M158 nicht die Cu+-Bindungsstöchiometrie zu AfCopAΔNΔC, wie durch ICP-MS gezeigt (Abb. 3b), was eher auf eine Rolle bei der Cu+-Aufnahme als auf die hochaffine Cu+-Bindung hinweist. In diesem Zusammenhang ist es erwähnenswert, dass die erhaltene Elektronendichtekarte rund um das CPC-Motiv, einschließlich der Seitenkette von M158, schlecht aufgelöst zu sein scheint. Wir waren daher daran interessiert, die Dynamik rund um die Cu+-Eintrittsstelle weiter zu bewerten, und wandten den in Phenix43,44 implementierten Ensemble-Verfeinerungsansatz an (Abb. 4b und ergänzende Abb. 14). Die erhaltenen Modelle stimmen gut mit der Gesamtdatenqualität überein, dh mit nur geringfügigen Variationen innerhalb der A-, P- und den meisten Teilen der M-Domäne sowie mit der Heterogenität um die Termini, periplasmatischen Schleifen und die N-Domäne. Wie aus der ursprünglichen Datenanalyse zu erwarten war, weisen das CPC-Motiv im abgewickelten Teil von M4 und die Seitenkette von M158 jedoch Konformationsflexibilität auf (Abb. 4b). Wenn man bedenkt, dass die Elektronendichtekarten für alle anderen Teile der M-Domäne von hoher Qualität sind, ist es verlockend zu spekulieren, dass die detektierte Dynamik die biologische Flexibilität in der Kupfereintrittsregion in der bestimmten E1-Konformation widerspiegelt. In diesem Sinne führten die MD-Simulationen, die den Cu+-Eintritt untersuchten, zu Wechselwirkungen mit M158, C380, C382, aber nicht mit den verbleibenden konservierten Resten, was darauf hindeutet, dass die Proteinkonformation das Ion koordinieren kann, aber noch nicht für die interne hohe Affinität geöffnet ist Bindungsstelle (ergänzende Abbildung 13). Daher ähnelt die identifizierte Stelle einer flexiblen, vorübergehenden Cu+-Eintrittsstelle für die Kupferaufnahme, was mit der isolierten frühen E1-Konformation übereinstimmt. Tatsächlich deuten zwei komplementäre 100-ns-MD-Simulationen mit einem Cu+, das ursprünglich in der trigonalen Schwefelposition von AfCopA platziert wurde, auf einen schnellen Transfer in Richtung M711 zusammen mit zwei oder drei koordinierenden Wassermolekülen hin (ergänzende Abbildung 13).

Wie erfolgt dann die Cu+-Aufnahme aus dem Milieu in P1B-ATPasen? Bemerkenswerterweise weist die ermittelte AfCopA-Struktur eine niedrige Elektronegativität in der Cu+-Aufnahmeregion um M158, C380 und C382 auf. Die Untersuchung einzelner Ensembles zeigt, dass nur geringfügige Umlagerungen um die Cu+-Eintrittsstelle einen starken Einfluss auf die elektrostatische Oberfläche haben (Abb. 4a). Insbesondere M158 hat einen starken Einfluss auf die der Umgebung ausgesetzte Ladung. Im Hinblick auf die HSAB-Theorie ist eine solche negativ geladene lokale Umgebung jedoch möglicherweise nicht für den Zugang und die Lieferung von Kupfer erforderlich. Stattdessen könnte das Vorhandensein einer Koordinationsumgebung, die reich an schwefelhaltigen „weichen“ Aminosäureliganden (wie Methioninen und/oder Cysteinen) ist, wie hier beobachtet, den Cu+-Transfervorgang antreiben.

In diesem Zusammenhang ist auch von Bedeutung, dass zytosolisches Cu+ im Gegensatz zu anderen Ionen jederzeit an Chaperone gebunden ist und nach dem aktuellen Modell voraussichtlich direkt von diesen kleinen löslichen Proteinen wie CopZ auf CopA24 übertragen wird.

Um diese Lieferung weiter zu untersuchen, haben wir mithilfe von pyDockWEB45 ein Homologiemodell des C-terminalen Teils von CopZ von A. fulgidus an die bestimmte E1-Konformation angedockt, was darauf hindeutet, dass CopZ gut in die Nut zwischen MB' und M2-4 passt ( Ergänzende Abbildung 15). In diesem Interaktionsmodell steht das im Allgemeinen elektronegative CopZ der elektropositiven MB'-Plattform gegenüber, was die Annahme stützt, dass die elektrostatische Komplementation die Bindung von CopZ an CopA24 steuert. Bestimmte Konformationen von M158, die durch unseren Ensemble-Verfeinerungsansatz erkannt wurden, liegen innerhalb von 6 Å vom CopZ-gebundenen Cu+-Ion (Abb. 4c), was zeigt, dass ein direkter Cu+-Transfer von CopZ auf M158 durchaus möglich sein könnte. Ein solcher direkter Transfer von Cu+ würde das Vorhandensein einer weiteren Übergangsstelle erfordern, an der M158 zusammen mit den CxxC-Cysteinen von CopZ gegenüber dem Zytosol beteiligt ist (Abb. 4). Cu+ würde dann an die durch M158, C380 und C382 gebildete Eintrittsstelle und die membranöse(n) hochaffine(n) Bindungsstelle(n) übergeben. Wir spekulieren, dass die oberflächenexponierten E205 und D336 an der Cu+-Aufnahme beteiligt sind, indem sie eine geeignete Umgebung schaffen, um die Freisetzung von CopZ zu stimulieren, oder durch die Stabilisierung des CopA-CopZ-Komplexes, wodurch die verfügbaren Mechanismen der Kupferaufnahme vereinheitlicht werden.

Frühere biochemische Studien, in denen die In-vitro-ATPase-Aktivität von Wildtyp-CopA, stimuliert durch freies (unter Verwendung von Cystein als Vehikel), Cu+ oder Cu+-beladenem CopZ, verglichen wurde, ergab, dass nur die Cu+-CopZ-stimulierte ATPase-Aktivität durch Alaninsubstitutionen im Eintrittsbereich abgeschafft wurde. während die durch freies Cu+ stimulierte ATPase-Aktivität unverändert blieb24. Dies stimmt nicht nur mit unseren Daten zu AfCopAΔNΔC (Abb. 3a) überein, sondern unterstreicht auch die spezifische Rolle von M158, E205 und D336 bei der Ionenaufnahme. Da Cu+ durch Chaperone an den ATPase-Kern abgegeben wird, scheinen diese Reste im Eintrittsbereich in vivo wichtig zu sein, wahrscheinlich weil sie eine geeignete Andock- und Transferregion für die Cu+-Freisetzung aus den Chaperonen erzeugen, kombiniert mit der sterischen Unfähigkeit der Chaperone, direkt dorthin zu gelangen die membranösen hochaffinen Cu+-Bindungsliganden. Cysteingebundenes Cu+ kann dieser Anforderung möglicherweise entgehen und M158 als Spender für die CPC-Cysteine ​​ersetzen. Somit liefert unsere E1-Struktur auch eine plausible Cu+-Spende-Hypothese an CopA-Proteine, indem sie die vorherigen, etwas widersprüchlichen Modelle der Ionenaufnahme kombiniert.

Basierend auf detaillierten Analysen des strukturell bestimmten E1-Zustands und Vergleichen mit bereits verfügbaren Strukturen in Kombination mit funktioneller Charakterisierung schlagen wir vor, dass kupferspezifische P1B-ATPasen den folgenden Transportmechanismus nutzen (Abb. 5). Der Übergang E2.Pi → E1 erfolgt zusammen mit größeren Konformationsänderungen, insbesondere einer großen Rotation der A-Domäne, die wahrscheinlich durch die Phosphatfreisetzung bei der Dephosphorylierung in Übereinstimmung mit dem konservierten alternierenden Zugriffsmechanismus der P-Typ-ATPase ausgelöst wird. Gleichzeitig verschiebt sich MA-M2 relativ zu M3-6, wodurch das ATPase-spezifische CPC-Motiv vom P1B-Typ von M4 dem Zytoplasma ausgesetzt wird (Abb. 2a und 4).

Im E2P-Zustand ist das konservierte CPC-Motiv in M4 dem extrazellulären Raum ausgesetzt. Der Übergang zur nach innen offenen E1-Konformation erfolgt durch Bewegungen von MA-M2 relativ zu M3-M6. Geleitet durch elektrostatische Wechselwirkungen dockt das zytosolische Chaperon CopZ an die MB'-Plattform an. Cu+ wird dann an die vorübergehende Ioneneintrittsstelle in der M-Domäne übergeben, die durch ein Methionin (M158) am zytosolischen Ende von M1 und die beiden Cysteine ​​(C380 und C382) des CPC-Motivs in M4 gebildet wird. Anschließend wird das Metall auf die hochaffine Ionenbindungsstelle(n) übertragen, die wahrscheinlich durch das CPC-Motiv und ein Methionin (M711) in M6 gebildet wird, bevor es in den extrazellulären Raum freigesetzt wird.

Die E1-Struktur stellt einen Cu+-Aufnahmezustand dar, der in der Lage ist, an frachtgebundenes CopZ zu binden, wie durch rechnergestütztes Docking bestätigt wurde. Alternativ kann Cu+ dem ATPase-Kern durch das N-terminale HMBD, das strukturell homolog zu CopZ ist, oder durch niedermolekulare Liganden wie Glutathion bereitgestellt werden. Die einzigartige Position der A-Domäne, die sich von P2- und P3-ATPasen unterscheidet, ist erforderlich, um ausreichend Platz für das Andocken von CopZ an den ATPase-Kern zu schaffen, da ihre Position in SERCA die Wechselwirkung sterisch behindern würde. Die mithilfe des Ensemble-Verfeinerungsansatzes bestimmte Ausrichtung der M158-Seitenkette zum Zytosol ermöglicht dann eine trigonal-planare Cu+-Koordination zusammen mit den Cysteinen des konservierten CxxC-Motivs von CopZ, d. h. einer vorübergehenden Stelle, die durch gemischte CopA-CopZ-Reste ohne direkte Verbindung gebildet wird Einfluss von E205 und D336 (Abb. 4), in Übereinstimmung mit dem zuvor für LpCopA38 vorgeschlagenen schwefelbasierten Transportweg. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass auch E205 und D336 direkt am Ionentransfer beteiligt sind. Im ermittelten E1-Zustand ermöglichen die Seitenkettenkonformationen von M158, C380 und C382 eine trigonal-planare Cu+-Koordination (Abb. 3b und 4). Dies wird durch ein anomales Signal an dieser Stelle gestützt, wie in dem am Cu+-Rand erfassten Datensatz festgestellt wurde. Das Metall wird vermutlich über M158 zur identifizierten Stelle transportiert und dann an die hochaffine Ionenbindungsstelle(n) in späteren E1-Zuständen weitergegeben, wahrscheinlich über C380 und C382. Wir stellen fest, dass M711 in der E1-Struktur eine andere Konfiguration angenommen hat, die zum Zentrum von M4-6 zeigt, was mit der Bildung einer einzelnen hochaffinen Stelle vereinbar ist (Abb. 2a – d). Die Freisetzung in den extrazellulären Raum kann später über den zwischen MA, M2 und M617 nachgewiesenen Freisetzungsweg erfolgen, wiederum in Übereinstimmung mit den in dieser Arbeit offenbarten Subdomänen MA-M2 und M3-6. Es wurde bereits vorgeschlagen, dass die Regulierung des PIB-Transports über die HMBDs erfolgen soll, die nachweislich den Umsatz bei Kupfermangel beeinträchtigen13. Interessanterweise ist die Position der letzten beiden HMBDs in der ATP7B-E2.Pi-Struktur von Daher ist es möglich, dass die Hemmung in E2-Zuständen auftritt, wobei ein HMBD zwischen der A- und der P-Domäne bindet und dass die Freisetzung des HMBD dann den Transport aktiviert.

Abschließend präsentieren wir hier die Struktur des Modellproteins AfCopA, einer kupfertransportierenden P1B-ATPase aus A. fulgidus, in einer nach innen gerichteten E1-Konformation. In diesem Zustand unterscheidet sich die Anordnung der A-Domäne im Vergleich zu anderen P-Typ-ATPase-Unterfamilien, was darauf hindeutet, dass der gesamte P-Typ-ATPase-Transportmechanismus weniger konserviert ist als bisher angenommen. Unsere Daten enthüllen den Mechanismus der Cu+-Aufnahme von zytosolischen Chaperonen und der Abgabe an den ATPase-Kern, bei dem M158 eine zentrale Rolle spielt. Dabei handelt es sich um zentrale Erkenntnisse, die wahrscheinlich auch auf die menschlichen Mitglieder ATP7A und ATP7B übertragbar sind. Allerdings sind zusätzliche metallgebundene Strukturen späterer E1-Zustände erforderlich, um die Architektur der hochaffinen Ionenbindungsstelle(n) in P1B-ATPasen zu entschlüsseln.

AfCopAΔNΔC (Reste G80-G736) (UniProtKB – O29777) wurde in pET-22b(+) kloniert und in Escherichia coli (Stamm C43) exprimiert. Die Zellen wurden in LB-Medium, ergänzt mit 0,1 mg/ml Ampicillin, bei 100 U/min und 37 °C in Kolben mit Schikanen kultiviert, bis die optische Dichte (OD600) 0,8 – 1 erreichte. Anschließend wurde die Proteinexpression durch Zugabe von 1 mM Isopropyl-β induziert -D-1-Thiogalactopyranosid (IPTG) und die Temperatur wurde auf 20 °C gesenkt. Nach 16 Stunden wurden die Zellen durch 15-minütige Zentrifugation bei 5000 × g geerntet. Die Zellen wurden in Puffer A (20 mM Tris-HCl pH = 7,6, 200 mM KCl, 20 % (v/v) Glycerin) mit 5 ml pro g Zellen resuspendiert und bis zur weiteren Verwendung bei –80 °C gelagert. Die Zellsuspension wurde vor dem Zellaufschluss mit 5 mM β-Mercaptoethanol (BME), 4 µg/ml DNase I, 1 mM MgCl2, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und Sigma-Proteaseinhibitoren (1 Tablette pro 6 l Zellkultur) ergänzt bei 25 kpsi in einem Hochdruckhomogenisator (Constant System). Zelltrümmer wurden durch 30-minütige Zentrifugation bei 20.000 × g entfernt, gefolgt von der Sammlung der Membranen durch 3-stündige Zentrifugation bei 185.500 × g. Die Membranen wurden in Puffer B (20 mM Tris-HCl pH = 7,6, 200 mM KCl, 20 % (v/v) Glycerin, 1 mM MgCl2, 5 mM BME) mit 10 ml pro g Membranen resuspendiert. Die Membranen wurden bis zur weiteren Verwendung bei –80 °C gelagert. Die Membranen wurden in 1 % (w/v) n-Dodecyl-β-D-maltopyranosid (DDM) bei 4 °C für 2 Stunden bei einer Proteinkonzentration von 3 mg/ml, bestimmt durch den Bradford-Assay, solubilisiert. Unlöslich gemachte Membranen wurden durch einstündige Ultrazentrifugation bei 185.500 × g pelletiert. Dem Überstand wurden 30 mM Imidazol und 500 mM KCl zugesetzt, und die Probe wurde dann auf eine 5 ml HiTrap Chelating HP-Säule (Cytiva) geladen. Die Säule wurde mit 10 Säulenvolumina (CV) Puffer C (20 mM Tris-HCl pH = 7,6, 200 mM KCl, 20 % (v/v) Glycerin, 1 mM MgCl2, 5 mM BME, 0,15 mg/ml Octaethylen) gewaschen Glykolmonododecylether (C12E8, von Nikkol) mit 50 mM Imidazol und anschließend in Puffer C mit zunehmender Imidazolkonzentration eluiert, endend mit 5 CV 500 mM Imidazol. AfCopAΔNΔC enthaltende Fraktionen wurden gepoolt und TEV-Protease wurde im Verhältnis 1:10 (Gew./Gew.) zugegeben. Die Probe wurde gegen 20 mM Tris-HCl pH = 7,6, 80 mM KCl, 20 % (v/v) Glycerin, 1 mM MgCl2, 5 mM BME, 0,15 mg/ml C12E8 bei 4 °C für 16 Stunden dialysiert, um Imidazol zu entfernen . Am folgenden Tag wurde die Probe mit 30 mM Imidazol ergänzt und festes KCl bis zu einer Endkonzentration von 500 mM zugegeben. Die Probe wurde erneut auf eine 5-ml-HiTrap-Chelating-HP-Säule (Cytiva) geladen, der Durchfluss mit gespaltenem AfCopAΔNΔC wurde gesammelt, mittels SDS-PAGE bewertet und in einem Vivaspin-Konzentrator (MWCO = 50 kDa) auf etwa 20 mg/ml konzentriert ). Zu diesem Zeitpunkt wurden routinemäßig 8–10 mg gereinigtes AfCopAΔNΔC aus 1 l Zellkultur gewonnen. 50 mg Protein wurden 10 Minuten lang bei 20.000 × g zentrifugiert, bevor sie auf eine selbstgepackte 120-ml-Superose™ 6-Säule (Cytiva) in Vorbereitungsqualität injiziert wurden. Das Protein wurde in Puffer D (20 mM Tris-HCl pH = 7,6, 80 mM KCl, 20 % (v/v) Glycerin, 3 mM MgCl2, 5 mM BME, 0,15 mg/ml C12E8) eluiert, und Fraktionen, die AfCopAΔNΔC enthielten, wurden eluiert gepoolt und in einem Vivaspin-Konzentrator (MWCO = 50 kDa) auf 10 mg/ml konzentriert. Das Protein wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur weiteren Verwendung in Aliquots bei −80 °C gelagert. Die Reinigungsergebnisse sind in der ergänzenden Abbildung 17 dargestellt.

Makromolekulare Kristallisationsversuche wurden unter Verwendung des HiLiDe-Ansatzes (hohe Konzentrationen an Lipid und Detergenz)25 durchgeführt. Eine 25 mg/ml-Stammlösung von 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DOPC) (Anatrace) in Chloroform wurde hergestellt und durch Chloroformverdampfung unter einem Stickstoffstrom ein dünner Lipidfilm in einem Glasfläschchen erzeugt . 10 mg/ml AfCopA-Proteinprobe und C12E8 wurden hinzugefügt, um Endkonzentrationen von 2,25 mg/ml DOPC und 5 mg/ml C12E8 zu erhalten. Die Probe wurde 16 Stunden lang bei 4 °C unter leichtem Rühren inkubiert. Aggregate wurden durch 20-minütige Ultrazentrifugation bei 50.000 × g entfernt, wonach 1 mM CuSO4 zum Überstand gegeben wurde (für die Apo-Kristalle wurde keine Ergänzung vorgenommen). Kristalle wurden unter Verwendung der Dampfdiffusionsmethode mit hängenden Tropfen in Platten mit 24 Vertiefungen gezüchtet, die 400 µL Reservoirlösung, ergänzt mit 5 mM BME, in Tropfen aus 1 µL Proteinprobe und 1 µL Reservoirlösung enthielten. Nach 10 Tagen in 1,5 M Ammoniumcitrat, 0,1 M MES, pH = 5,5, wurden Kristalle mit einer Beugungsgröße von 3,3 – 3,5 Å erhalten. Endgültige Daten der Beugung bis 2,8 Å wurden an einem Kristall gesammelt, für den 5,0 mM 06:0 Lyso PC (Avanti) als Additiv verwendet wurde. Alle Kristalle wurden mit LithoLoops (Molecular Dimensions) gefischt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Daten wurden an der Swiss Light Source, dem Paul Scherrer Institut, Villigen, Schweiz, Strahllinie X06SA gesammelt.

Die gesammelten Daten wurden mit XDS46 verarbeitet und skaliert. Die Bestimmung und Verfeinerung der nachgelagerten Struktur wurde mit Phenix44 durchgeführt. Erste Phasen wurden in PHASER47 durch molekularen Ersatz erhalten, wobei die Strukturen der löslichen A- und PN-Domänen von AfCopA (PDB-IDs 2B8E und 3A1C)20,21 zusammen mit der M-Domäne von LpCopA (PDB-ID 3RFU)16 angewendet wurden als Suchmodelle. Der erste Modellbau wurde in Coot48 durchgeführt, und die Rosetta-Verfeinerung49 wurde in den frühen Phasen des Modellbaus eingesetzt. Die Daten ermöglichten die Modellierung von Seitenketten in den A-, P- und M-Domänen und die Seitenkettenkonformationen in der N-Domäne wurden anhand verfügbarer Kristallstrukturen (PDB-ID 3A1C)21 gesteuert. Das endgültige Modell umfasst die Reste 82–736, wobei nur 4 Reste am N-Terminus der hier genutzten verkürzten Form fehlen. Alle Strukturfiguren wurden mit PyMOL50 generiert, wobei das PyMol APBS-Elektrostatik-Plugin51 für elektrostatische Oberflächendarstellungen verwendet wurde. Um das AfCopA-AfCopZ-Docking-Modell zu etablieren, wurde in SwissModel52 ein Homologiemodell des CxxC-beherbergenden C-terminalen Teils von AfCopZ unter Verwendung der E. hirae CopZ-Struktur (PDB-ID 1CPZ)53 als Vorlage erstellt. Das Andocken an die ermittelte AfCopA E1-Struktur (hochauflösender Datensatz) wurde mit pyDockWEB mit den Eingaben N157-D159 (AfCopA), C149 + C152 (AfCopZ) durchgeführt.

Mutierte Plasmide wurden mit dem QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies) erzeugt. Punktmutanten wurden als Wildtyp in Duplikaten von 2 l LB-Medium pro Mutante, basierend auf separaten Transformationskolonien, exprimiert. Die Membranvorbereitung und -reinigung wurde wie oben für den Wildtyp AfCopAΔNΔC beschrieben durchgeführt, jedoch mit den folgenden Unterschieden: Membranen aus 2-l-Zellkulturen wurden 2 Stunden lang in 60 ml Puffer B, ergänzt mit 1 % DDM, solubilisiert. Solubilisiertes Material wurde 1 Stunde lang bei 4 °C mit 1 ml losem Ni-Sepharose™-Harz (Cytiva), äquilibriert in Puffer C, inkubiert, anschließend wurde eine Affinitätsreinigung unter Verwendung von Schwerkraftsäulen durchgeführt. Die Probe wurde zweimal geladen und das Harz wurde dann zuerst mit 5 ml Puffer C und anschließend mit 10 ml Puffer C mit 50 mM Imidazol gewaschen. Das Protein wurde in 5 ml Puffer C mit 500 mM Imidazol eluiert und 1 mg TEV-Protease pro Probe hinzugefügt. Am folgenden Tag wurde die Probe mit 1 ml frischem, in Puffer C äquilibriertem Ni-Harz 1 Stunde lang bei 4 °C inkubiert und dann zweimal auf Schwerkraftsäulen geladen. Der Durchfluss, der gereinigte AfCopAΔNΔC-Mutanten enthielt, wurde gesammelt und auf 20 mg/ml konzentriert. Das gesamte Material (3–10 mg Protein, abhängig von der Mutation) wurde in eine Superose 6 Creating 10/300 GL-Säule (Cytiva) injiziert und in Puffer D eluiert. Die Mutanten wurden auf > 5 mg/ml konzentriert und in Flüssigkeit schockgefroren Stickstoff versetzt und bis zur weiteren Verwendung bei −80 °C gelagert.

Zur Liposomenherstellung wurde durch Chloroformverdampfung einer Stammlösung unter einem Stickstoffstrom ein dünner Film aus 20 mg DOPC erzeugt und 16 Stunden lang in einen Vakuumexsikkator gegeben. Alle Puffer wurden vor der Verwendung mit Chelex® 100 Chelating Resin (Bio-Rad) behandelt. Der Lipidfilm wurde in 20 mM MOPS-KOH pH = 6,8, 100 mM NaCl, 1 mM frisch zubereiteter Ascorbinsäure, 10 mM frisch zubereitetem Cystein rehydratisiert und für 3 × 15 Minuten in ein Ultraschallbad gegeben. Die Probe wurde drei Gefrier-Tau-Zyklen in flüssigem Stickstoff ausgesetzt und anschließend 11 Mal durch 100-nm-Filter (Avanti) extrudiert. Die Liposomen wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert.

Die Liposomen wurden aufgetaut und durch Zugabe von 0,01 % (Gew./Vol.) DDM für 1 Stunde bei 18 °C destabilisiert. Die Rekonstitution erfolgte bei einem Lipid:Protein-Molverhältnis von 20:1 mit einer Endproteinkonzentration von 0,5 mg/ml. Konzentrierte Proteinproben und Liposomen wurden mit Rekonstitutionspuffer (20 mM MOPS-KOH pH = 6,8, 100 mM NaCl, 1 mM Ascorbinsäure), ergänzt mit 0,15 mg/ml C12E8, gemischt und 1 Stunde lang bei 4 °C inkubiert. Das Reinigungsmittel wurde durch Zugabe von Bio-Beads™ SM-2-Harz nach 1 Stunde, 2 Stunden und 18 Stunden entfernt. Proteoliposomen wurden durch 1,5-stündige Zentrifugation bei 60.000 × g gesammelt und in Rekonstitutionspuffer resuspendiert. Die Proben wurden dann zur Messung der In-vitro-ATPase-Aktivität verwendet, indem ein ursprünglich von Baginski und Kollegen entwickelter Test eingesetzt wurde54. Kurz gesagt wurden 0,2 mg/ml Proteoliposomen zu 20 mM MOPS-KOH pH = 6,8, 100 mM NaCl, 1 mM Ascorbinsäure, 10 mM Cystein und 100 µM CuCl2 hinzugefügt. Der Assay wurde bei 65 °C durchgeführt und die Proben wurden 10 Minuten vor Beginn der Reaktion durch Zugabe von 5 mM ATP (Sigma Aldrich) inkubiert. 50 μl der jeweiligen Reaktionsmischungen wurden in eine Mikroplatte mit 96 Vertiefungen überführt und mit einem gleichen Volumen Ascorbinsäurelösung (gebildet durch Mischen einer Lösung mit 0,17 M Ascorbinsäure und 0,1 % SDS in 0,5 M HCl mit wässriger 28,3 mM Ammoniumheptamolybdatlösung) gemischt im Verhältnis 5:1, alle von Sigma Aldrich) nach 5, 12 und 18 Min. Die Farbentwicklung wurde durch Zugabe von 75 μl Natriumarsenlösung (bestehend aus 0,068 M Trinatriumcitrat, 0,154 M Natriummetaarsen und 2 % Vol./Vol. Eisessig, alle von Sigma Aldrich) nach 10-minütiger Inkubation bei 18 °C gestoppt. Nach 30-minütiger Inkubation wurde die Absorption bei 860 nm gemessen. Die präsentierten Daten stammen aus mindestens 5 unabhängigen Messungen an Proben biologischer Duplikate. Wie auch von anderen angemerkt12,55, weisen CopA-Proben in Abwesenheit von zugesetztem Kupfer eine hohe Hintergrundaktivität auf, was unserer Meinung nach auf Spuren von Restkupfer in unseren Proben zurückzuführen ist. Eine Hintergrundaktivität von 30 % wurde von den aufgezeichneten Werten abgezogen (ergänzende Abbildung 17). Abbildungen, die ATPase-Aktivitätsmessungen darstellen, wurden mit GraphPad Prism erstellt.

Die Cu+-Bindungsstöchiometrie in Wildtyp-AfCopA und Mutanten wurde durch ICP-MS-Analyse bestimmt. Die gereinigten Proteinvorräte wurden mit einem Puffer, der 20 mM Tris pH = 7,6, 80 mM KCl, 20 % (v/v) Glycerin, 3 mM MgCl2, 5 mM BME und 0,15 mg/ml C12E8 enthielt, auf 1 mg/ml verdünnt. 4 Cu2+-Äquivalente (aus einer CuCl2-Stammlösung in H2O) wurden zu den Proteinlösungen gegeben und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Überschüssiges und ungebundenes Kupfer wurde durch Injektion der Proteinlösungen durch eine mit Puffer voräquilibrierte 5-ml-HiTrap-Entsalzungssäule entfernt. Die Konzentration der eluierten Proteine ​​wurde über einen Bradford-Assay mit Rinderserumalbumin (BSA) als Standard bestimmt. Die eluierten Proteinproben wurden 12 Stunden lang in 8 % (w/v) HNO3 (Sigma-Aldrich) bei 80 °C verdaut. Die Proben wurden anschließend verdünnt, um die HNO3-Konzentration auf endgültige 3 % (Gew./Vol.) einzustellen, und der Kupfergehalt in den Proben wurde mit einem Agilent 7900 ICP-Massenspektrometer analysiert, das zur Probeninjektion an einen automatischen Probengeber CETACASX-500 angeschlossen war. Zur Hintergrundkorrektur wurden Kontrollexperimente unter Verwendung von Proteinpuffer ohne Protein durchgeführt. Abbildungen, die ICP-MS-Messungen darstellen, wurden mit GraphPad Prism erstellt.

Zwei Ensembles, die sich in der CPC-Region unterschieden (in Abb. 4b als I und II bezeichnet), wurden mit dem CHARMM-GUI-Membranbuilder in DOPC-Membranpflaster (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin) eingefügt. Der Aminosäurerest E457 wurde wie von PROPKA3.157,58 vorhergesagt protoniert. Die Systeme wurden in TIP3P-Wasser und 150 mM NaCl solvatisiert und die Energie mit einem 5.000-stufigen Steilabfall-Algorithmus minimiert. Die Systeme wurden durch allmähliche Freigabe der Positionsbeschränkungen aus dem Wasser und den Lipiden für insgesamt 30 ns ins Gleichgewicht gebracht, gefolgt von 250 ns langen, nicht eingeschränkten Produktionsläufen. Jede Proteinkonformation wurde auch in unabhängigen Wiederholungssimulationen simuliert, beginnend mit einem anderen Satz von Anfangsgeschwindigkeiten, was sich auf eine Gesamtprobenahme von 250 ns × 4 summierte. Eine Nose-Hoover-Temperaturkopplung59 wurde unter Verwendung einer Referenztemperatur von 303,15 K angewendet. Die isotrope Parrinello-Rahman-Druckkupplung60 wurde mit einem Referenzdruck von 1 bar und einer Kompressibilität von 4,5e-5 bar−1 angewendet. Die Systeme wurden mit dem Simulationspaket GROMACS-202161 und CHARMM36 All-Atom-Kraftfeldern62 simuliert. Die Membrandomäne wurde als Ausrichtungsreferenz für die quadratische Mittelwertabweichung verwendet, die eine stabile Entwicklung für das Proteinrückgrat zwischen 150 und 250 ns jeder Trajektorie zeigte. Wir extrahierten eine repräsentative Durchschnittsstruktur aus dem 150–250 ns langen Schnitt aller vier Trajektorien und führten ein Cu+-Ion an einer zytoplasmatischen Position 5 Å über dem durch die CopZ-Docking-Analyse angezeigten Pfad ein. In einer kurzen 20-ps-Simulation wurde das Cu+-Ion dann mit 1 Å/ps und einer Kraftkonstante von 1000 kJ mol−1 nm−2 in z-Richtung entlang der Membranvertikale gezogen. Um die Wechselwirkungen mit potenziell koordinierenden Resten zu untersuchen, haben wir auch die AfCopA-Struktur simuliert, wobei das Cu+-Ion zunächst an der aus den experimentellen Beobachtungen angegebenen Position platziert wurde (wie in Abb. 4d). Hier wurden zwei unabhängige Systeme für 2 ns energieminimiert und äquilibriert, wobei Positionsbeschränkungen für Protein, Lipide und Ionen schrittweise aufgehoben wurden, gefolgt von Produktionssimulationen für 100 ns.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten Strukturkoordinaten wurden in der Proteindatenbank unter den Zugangscodes hinterlegt: 7R0I (E1 in Gegenwart von Kupfer), 7R0H (E1 in Gegenwart von Kupfer mit Daten, die am Kupferrand gesammelt wurden), 7R0G (E1 in das Fehlen von Kupfer). Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt. Alle Daten und Materialien, die die Ergebnisse des Manuskripts stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Das PhD-Studium über NS wurde von der Lundbeck Foundation finanziert. Das Postdoc-Stipendium von CG wurde vom BRIDGE – Translational Excellence Program an der Universität Kopenhagen unterstützt, das von der Novo Nordisk Foundation finanziert wird. CG wurde auch finanziell von der Gedenkstiftung des Fabrikanten Vilhelm Pedersen und seiner Frau sowie dem Aarhus Wilson-Konsortium unterstützt. PG wird von den folgenden Stiftungen unterstützt: Lundbeck (R313-2019-774, R133-A12689 und R346-2020-2019), Knut und Alice Wallenberg (2020.0194 und 2015.0131), Carlsberg (CF15-0542), Novo-Nordisk (NNF13OC0007471) , Brødrene Hartmann (A29519), Agnes og Poul Friis, Augustinus (16-1992), Crafoord (20200739, 20180652 und 20170818) sowie The Per-Eric und Ulla Schyberg (38267). Die Finanzierung erfolgte außerdem durch den Independent Research Fund Denmark (9039-00273 und 6108-00479), den Swedish Research Council (2016-04474 und 521-2012-2243) und durch ein Michaelsen-Stipendium. GM wurde vom National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health (R35GM128704), der Robert A. Welch Foundation (AT-1935-20170325 und AT-2073-20210327) und der National Science Foundation (CHE-2045984) unterstützt ). MA wird vom schwedischen Forschungsrat unterstützt (2020-03840). Wir danken Jose M. Argüello für die Bereitstellung des AfCopA-Gens und Julie Winkel Missel für ihre Hilfe bei der Liposomenvorbereitung. Wir sind dankbar für die Unterstützung beim Kristallscreening und der Datenerfassung an der Synchrotron Lichtquelle Schweiz, dem Paul Scherrer Institut, Villigen, Strahllinie X06SA. Der Zugang zu Synchrotronquellen wurde durch das Danscatt-Programm des Danish Council of Independent Research unterstützt. Die Berechnungen wurden mit Ressourcen durchgeführt, die von der schwedischen National Infrastructure for Computing (SNIC) über das High-Performance Computing Centre North (HPC2N) und das National Supercomputer Centre (NSC) im Rahmen der Projekte SNIC 2021/5-301 und SNIC 2021/5-362 bereitgestellt wurden , SNIC 2022/22-441 und SNIC 2022/5-168.

Open-Access-Finanzierung durch die Universität Lund.

Abteilung für Biomedizinische Wissenschaften, Universität Kopenhagen, Maersk Tower 7-9, Nørre Allé 14, DK-2200, Kopenhagen, Dänemark

Nina Salustros, Christina Greenberg, Pin Lyu, Kaituo Wang und Pontus Gourdon

Abteilung für Chemie und Biochemie, The University of Texas at Dallas, 800W Campbell Rd., Richardson, TX, 75080, USA

Nisansala S. Abeyrathna & Gabriele Meloni

Fachbereich Biologie, Universität Kopenhagen, Universitetsparken 13, DK-2100, Kopenhagen, Dänemark

Pin Lyu

Fachbereich Chemie, Universität Umeå, Linneaus Väg 10, SE-901 87, Umeå, Schweden

Fredrik Orädd und Magnus Andersson

Abteilung für experimentelle medizinische Wissenschaft, Universität Lund, Sölvegatan 19, SE-221 84, Lund, Schweden

Pontus Gourdon

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CG und PG haben das Projekt initiiert. NS, CG und PG trugen zur Identifizierung wissenschaftlicher Probleme, zur experimentellen Planung, zur Datenanalyse und zur Interpretation bei. NS und CG führten die Klonierung, Überproduktion und Reinigung für die Struktur- und Funktionsstudien durch, außerdem stellten sie mit Unterstützung von PLNS die Kristalle her, NS und CG sammelten Beugungsdaten und bestimmten die Struktur. KW leistete Unterstützung bei der Strukturbestimmung. NS und CG verfeinerten die Strukturen. NS führte ATPase-Aktivitätstests durch. NA führte ICP-MS-Messungen unter Aufsicht von GMFO durch und MA führte MD-Simulationen durch. NS hat die Zahlen vorbereitet. NS, CG und PG haben den ersten Entwurf geschrieben. Alle Autoren kommentierten das Manuskript. CG und PG betreuten das Projekt.

Korrespondenz mit Pontus Gourdon.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Lin Bai und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Salustros, N., Grønberg, C., Abeyrathna, NS et al. Strukturelle Grundlagen der Ionenaufnahme in kupfertransportierenden ATPasen vom P1B-Typ. Nat Commun 13, 5121 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32751-w

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Eingegangen: 01. März 2022

Angenommen: 16. August 2022

Veröffentlicht: 31. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32751-w

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